Protocolos de los termocicladores (PCR)

octubre 25, 2021by Kalstein
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Un termociclador es un equipo de laboratorio que permite llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de forma eficiente y rápida, por medio de la realización automática y cíclica de los cambios de temperatura que se requieren para la amplificación de una cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN), a partir de una enzima termoestable. La PCR posibilita que una pequeña cantidad de moléculas de ADN sea amplificada muchas veces, de manera exponencial.

El protocolo de esta técnica se basa en sintetizar muchas veces un fragmento de ADN empleando una enzima polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79°C a 85°C), conocida como taq polimerasa.

Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en el interior celular cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar, los oligonucleotidos (primers, iniciadores, cebadores) necesarios para que se inicie la transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo  de cada polimerasa). Esta técnica tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense.

¿Cómo funciona la técnica de PCR?

Si ya disponemos de los tubos con todo lo necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucleotidos, ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y oligonucleotidos). El siguiente paso es colocar los tubos en el termociclador, que básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas.

¿Cómo es que se amplifica el fragmento de ADN que queremos?

El termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (conocidos como ciclos de reacción), la primera es a 95°C (desnaturalización) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40 °C y 60 °C (alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrogeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias) duraran mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena).

La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más, los puentes de hidrogeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. Después la temperatura sube a 72 °C (paso que se conoce como extensión), ya que 72 °C es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continua la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se habían alineado.

En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se formarán los primeros fragmentos a partir del ADN genómico. Después se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio, también se unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo, por lo tanto, en este segundo paso la polimerasa sintetizara dos fragmentos largos copiados directamente del ADN y dos fragmentos del tamaño esperado, que es el tamaño que hay entre los dos oligonucleótidos que hemos usado. De esta forma con cada ciclo aumentara el número de fragmentos del tamaño que queremos.

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