Electroforesis: pasos para una corrida de geles

noviembre 9, 2021by Kalstein
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La electroforesis es una técnica de biología molecular donde se emplea la corriente eléctrica controlada para separar biomoléculas según su relación tamaño a carga eléctrica, usándose como base una matriz gelatinosa (gel).

Uno de los usos comunes de esta técnica es en la realización es la llamada electroforesis de ADN que puede realizarse en geles de agarosa o de poliacrilamida. Ambos tienen características diferentes en cuanto a sus propiedades y modo de preparación, por lo que se usara uno u otro en función de la aplicación y objetivos que se persigan. La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no necesitamos un alto poder de resolución. Por su parte, la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), tiene un poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un sólo par de bases. Los geles de poliacrilamida se corren de forma vertical y poseen la desventaja de ser más complicados en su elaboración y manipulación.

En este articulo nos centraremos en los pasos para realizar una corrida de electroforesis de ADN en geles de agarosa:

Preparación del gel de agarosa

  • Pesar la cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración deseada en función del volumen de gel.
  • Añadir la agarosa al buffer (TAE 1x o TBE 0.5x) en un matraz.
  • Calentar la mezcla en un horno de microondas hasta que se observe que toda la agarosa se ha fundido.
  • Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50 °C.
  • Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a hacer el gel sellando los bordes con cinta masking, o colocándolo en el dispositivo previsto para ello, y colocando el peine en la posición deseada.
  • Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado y dejar que solidifique durante al menos 30 min.

Preparación de las muestras

  • Mezclar tanto las muestras de ADN como el marcador de tamaño con 0.2 volúmenes del buffer de carga 6x. El volumen total estará determinado por el tamaño de los pocillos, habitualmente 15-30 µl.

Carga de las muestras y corrida del gel

  • Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde con el gel en la cámara de electroforesis.
  • Añadir buffer de electroforesis (TAE 1x o TBE 0.5x) hasta que cubra el
  • gel unos 3-5 mm.
  • Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las muestras.
  • Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el paso 7.
  • Conectar los cables a la fuente alimentación y aplicar un voltaje de 20-150 V (1-5 V/cm de acuerdo a la distancia entre los electrodos). El ajuste del voltaje es muy variable dependiendo de la cámara y de los tamaños que se pretenden separar, se recomienda voltajes no muy altos para tamaños muy grandes del ADN.
  • Correr el gel hasta que el colorante azul de bromofenol esté a una distancia del borde de aproximadamente un 25% de la longitud total del gel. En ese momento debe detenerse la electroforesis.

Tinción del gel y visualización del ADN

  • Si no se añadió el Bromuro de etidio al gel, éste debe teñirse una vez finalizada la electroforesis. Para ello se saca el gel de su molde y se sumerge en una solución de Bromuro de etidio (0.5 µg/ml) durante al menos 15 min.
  • Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lámpara de luz ultravioleta (λ ≈ 300 nm), el ADN se visualizará como bandas de color anaranjado.
  • Fotografiar el gel con el sistema fotográfico disponible.

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